1. 层析硅胶活化
1.吸附剂的处理及柱子装填
将一定量薄层层析硅胶装人搪瓷盘置于烘箱中，于105C活化2H后，取出放置室温即可装柱。柱子采用干法填充，填满整个柱体，不留死体积，密封后用柱塞式计量溶剂泵按丙酮一石油醚(5:95)比例泵人溶剂，至溶剂流出止。
2.上样
将冬凌草的乙醇提取物400G用适量丙酮溶解，泵人中压柱柱头，然后泵人石油醚1000RID。
3.洗脱
以一定比例的石油醚一丙酮为洗脱液，60ML/MIN的流速进行梯度洗脱，柱的使用压力为2~ 3KG/C 。按每份500ML收集，TLC检识展开剂丙酮一(2:8)，显色剂5%香草醛浓硫酸乙醇液
至洗脱完全，相同流份合并，回收溶剂。将冬凌草甲素流份合并蒸干。加人适量甲醇热溶后自然放置，析出结晶，为冬凌草甲素。
4.层析柱再生、平衡
有效成分经TLC检识全部流出后，用纯丙酮5000ML再生，丙酮一石油醚(5:95)平衡后，可再次上样，反复使用(使用次数随原料不同而异，一般可连续使用2-6个月以上)。
5.重结晶
冬凌草甲素结晶析出完全后，减压过滤，然后用少量甲醇洗涤(洗涤液保留，作下次热溶冬凌草甲素用)。将冬凌草甲素再用适量甲醇热溶后放置，结晶再次析出，待结晶完全后，抽滤，用少量洗涤，将结晶室温下晾干后置真空干燥箱中，35度真空干燥至恒重。密封于瓶中，置干燥器中保存。
6.薄层层析分析
取适量冬凌草甲素对照品及由上述方法得到的冬凌草甲素样品甲醇溶解后点于同一硅胶G薄层板上，以一丙酮(8:2)为展开剂进行展开，5% 香草醛浓硫酸乙醇液显色，于105。C烘至斑点清晰。表明在该展开系统下，冬凌草甲素样品和对照品都具有相同的RF值，并呈现出同样的蓝绿色斑点，在制备的冬凌草甲素样品中，没有杂质斑痕。
2. 硅胶层析法应用
硅胶层析法的分离原理是：根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。也就是说，利用吸附的特性起分子筛的作用。
3. 硅胶层析原理
1、干法装柱吗？硅胶被洗脱剂浸透后会出现透明的现象。
2、硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，a与b的吸附力相差较大时，a会替代b被硅胶吸附，但不会是100％被替代。3、一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。4、整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。5、若可以使用其它试剂，最好不用苯，苯的毒性相对较大。4. 层析硅胶的制作过程
一，原理
柱层析操作时，先在圆柱管中填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。
柱层析法
二，使用方法
从天然产物中提取、分离和表征生物小分子，是新药研发中获得先导化合物的主要途径之一。层析法（Chromatography）是天然产物分离较为常用的方法之一。 层析法较早是根据化合物颜色分离一些植物色素，如今，层析法已经演变成为一种高度敏感的、有效的化合物分离和鉴定方法。柱层析一般包括常压柱层析、中压柱层析和高压柱层析。按照柱填料又可分为柱层析硅胶、离子交换层析、凝胶渗透色谱、疏水作用色谱等，其中以柱层析硅胶（正/反相）使用较为为广泛。与其他层析方法相比，柱层析具有操作简单，经济实惠 ，样品承载量大等优点，是天然产物分离纯化的方法之一。
5. 层析硅胶再生与活化
不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行（一般在170cC以上即有少量结合水失去）。 层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17%，吸附力极弱不能用作为吸附剂，但可作为分配层析中的支持剂。